Transformasi
dan Ekspresi Gen GUS pada Beberapa Jaringan Tanaman Kakao
Transformation and expression of GUS gene in
several tissues of cocoa
Moch. Agus Krisno Budiyanto, Rian Adi Pranata
Program
Studi Pendidikan Biologi,
Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan Universitas
Muhammadiyah Malang
Email: rian_adipranata@gmail.com
Jl. Tlogomas 246 Malang Telp 464318
Abstract
The
problem of pod borer pest in cocoa plantation in Indonesia and the advantages
of genetic engineering in plant genetic improvement have led to the development
of DNA transformation system in cocoa. Tissue culture technique for cocoa faces
some problem, mainly in plant regeneration and possibility of somaclonal
variation. This research aims at developing a method for DNA transformation
into cocoa cells. Several factors that may affect transformation were studied.
Preculture treatment before inoculation of cocoa explant did not increase
transformation efficiency. To obtain the most suitable explant fot the
transformation as well as regeneration, fresh explants of leaves, petals, and
zygotic embryos were tested. Of those fresh explants, the zygotic embryos, and
petals could be transformed and expressed the reporter gene. In addition, the
use of the zygotic embryos is predicted to minimize the occurrence of
somaclonal variations.
Key word:DNA Transformation, GUS,
Agrobacterium
Abstrak
Masalah hama penggerek buah pada perkebunan
kakao di Indonesia dan keunggulan rekayasa genetik dalam perbaikan genetik
tanaman telah mendorong dikembangkannya metode transformasi DNA ke dalam tanaman
tersebut. Teknik kultur jaringan tanaman kakao yang diperlukan dalam usaha
tersebut menghadapi kendala pada rendahnya tingkat regenerasi dan kemungkinan
terjadinya variasi somaklonal. Artikel ini bertujuan untuk mengembangkan metode
transformasi DNA pada sel tanaman kakao. Beberapa factor yang berpengaruh telah
dikaji. Perlakuan prakultur terhadap eksplan kakao sebelum inokulasi tidak
meningkatkan effisiensi transformasi. Untuk mendapatkan sumber eksplan yang
paling sesuai dalam transformasi DNA dan regenerasi tanaman kakao transgenik
nantinya, telah dicoba beberapa jaringan segar. Dari jaringan segar tersebut,
jaringan embrio zigotik dan kelopak bunga dapat dimasuki dan mengekspresikan
secara transien gen reporter GUS dengan baik. Pemakaian jaringan embrio zigotik
diperkirakan dapat mengatasi masalah regenerasi pada kultur jaringan tanaman
kakao dan variasi somaklonal.
Kata kunci:DNA
Transformation, GUS, Agrobacterium
PENDAHULUAN
Teknologi DNA rekombinan
atau rekayasa genetika telah mela- hirkan revolusi baru dalam berbagai bidang kehidupan manusia yang
dikenal sebagai revolusi gen. Produk teknologi tersebut berupa organisme
transgenik atau orga- nisme hasil modifikasi genetic
tersebut.
Perbaikan
sifat tanaman kakao melalui pumuliaan konvensional menghadapi kendala sempitnya
keragaman genetik dan lamanya siklus seleksi. Sifat-sifat unggul yang diminati
umumnya tidak dimiliki oleh tetua-tetua tanaman kakao yang digunakan dalam
penyilangan. Selain itu, masa praproduktif yang panjang menyebabkan lamanya siklus
seleksi.
Rekayasa
genetik yang tidak dibatasi oleh kompatibilitas seksual diperkirakan dapat
mengatasi masalah sempitnya keragaman sumber daya genetik. Gen yang membawa
sifat unggul yang diminati dapat berasal dari berbagai sumber. Selain itu, terjadi
pemindahan sifat yang dibawa oleh gen tersebut dapat diperkirakan secara
molekuler pada tingkat sel. Dengan demikian proses seleksi dapat berlangsung
lebih efisien, karena hanya sel atau tanaman yang membawa dan atau
mengekspresikan transgen saja yang perlu dikembangbiakkan.
Metode transformasi
genetik pada tanaman dengan perantaraan Agrobacterium tumefaciens merupakan
metode yang umumnya digunakan untuk mengintroduksi gen asing ke dalam genom tanaman.Keberhasilan
transformasi genetik tanaman ditandai
dengan integrasi, ekspresi dan stabilitas gen yang disisipkan dalam
tanaman/bagian tanaman beserta keturunannya
Salah
satu masalah yang dihadapi pada rekayasa genetik tanaman kakao adalah berkaitan
dengan kultur jaringan tanaman. Meskipun kultur jaringan tanaman kakao di
Indonesia telah dimulai lebih dari satu dasawarsa (Tahardi, 1984), hasilnya
belum memuaskan (Tahardi dan Mardiana, 1995; Santoso et al.,1997).
Sistem
kultur jaringan yang baik merupakan prasyarat bagi keberhasilan rekayasa
genetik tanaman. Transformasi DNA pada sel tanaman kakao dilaporkan oleh
beberapa pakar, antara lain Purdy dan Dicstein (1989) yang menginduksi tumor
pada biji kakao menggunakan Agrobacterium
tumefaciens.
Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens
adalah bakteri patogen pada
tanaman yang banyak digunakan untuk memasukkan gen asing ke dalam sel tanaman
untuk menghasilkan suatu tanaman
transgenik. Secara alami, A. tumefaciens dapat menginfeksi tanaman dikotiledon melalui
bagian tanaman yang terluka sehingga menyebabkan tumor mahkota empedu (crown
gall tumor).
Bakteri yang tergolong ke dalam gram negatif ini memiliki sebuah plasmid besar yang disebut plasmid-Ti yang
berisi gen penyandi faktor virulensi penyebab infeksi bakteri ini
pada tanaman. Untuk memulai pembentukan tumor, A. Tumefaciens harus menempel terlebih dahulu pada
permukaan sel inang dengan memanfaatkan polisakarida asam yang akan digunakan untuk mengkoloniasi/menguasai
sel tanaman.
Gambar 1. A.
tumefaciens
Selain tanaman dikotiledon, tanaman monokotiledon seperti jagung, gandum, dan tebu telah
digunakan untuk memasukkan sel asing ke dalam genom tanaman. Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri
patogen pada tanaman yang banyak digunakan untuk memasukkan gen asing ke dalam
sel tanaman untuk menghasilkan suatu tanaman transgenik.
Artinya: (yaitu)orang-orang yang mengingat Allah
sambil berdiri atau duduk atau dalam keadaan berbaring dan mereka memikirkan
tentang penciptaan langit dan bumi (seraya berkata): "Ya Tuhan kami, tiadalah
Engkau menciptakan ini dengan sia-sia, Maha Suci Engkau, maka peliharalah kami
dari siksa neraka(Q.s Al-
Imran ayat 191).
Dalam surat Al-Imran ini
menjelaskan bahwa segala sesuatu yang di ciptakan oleh Allah SWT dimuka bumi
ini dari hal terkecil sampai hal terbesar mempunyai maksud dan tujuan untuk kehidupan
manusia dimuka bumi
(Kimball,
J. 2009.).
Transformasi
Gen
Transformasi gen adalah proses dimana DNA asing dimasukkan kedalam sel tanaman,
dimana para pemulian tanaman dapat memasukkan gen asing kedalam
sel
atau jaringan tanaman, baik secara langsung maupun tak langsung tanpa merujuk
kepada tingkat hubungan genetik atau kompatibelilitas suatu jenis.
Perkembangan ilmu dan teknologi merupakan konsekuensi logis dari konsep ilmu
dalam al- Qur’an yang mengatakan
hakekat ilmu adalah menemukan sesuatu yang baru bagi masyarakat dari hal yang
tidak tahu menjadi tahu salah satunya kloning gen yang dijelaskan
dalam firman Allah Surat Al-Baqoroh ayat 151:
Artinya: Sebagaimana
kami telah mengutus kepadamu Rasul diantara kamu yang membacakan ayat-ayat kami
kepada kamu dan mensucikan kamu dan mengajarkan kepadamu al-kitab
dan hikmah serta mengajarkan kepada kamu apaapa yang belum kamu ketahui(Q.s
Al-Baqoroh ayat 151).
Teknologi pemindahan gen atau transfer gen dapat
dibedakan menjadi dua, yaitu langsung dan tidak langsung. Contoh transfer gen
secara langsung adalah perlakuan pada protoplas tanaman dengan eletroporasi, penembakan eksplan gen dengan gene
gun atau di vortex dengan karbit
silikon.
Teknik pemindahan gen secara tak langsung dilakukan
dengan bantuan bakteri Agrobacterium. Dari banyak teknik transfer
gen yang berkembang, teknik melalui media vector
A.
tumefaciens paling sering di gunakan untuk metransformasi
tanaman, terutama tanaman kelompok dikotil. Bakteri ini mampu mentransfer gen
kedalam genom tanaman melalui eksplan baik yang berupa potongan daun (leaf
disc ) atau bagain lain dari jaringan tanaman yang mempunyai potensi
beregenerasi tinggi.(Adis.2010.)
Transfer
gen dilakukan melalui A. Tumefaciens. Keberadaan
transgen tersebut di dalam jaringan tanaman diuji dengan teknik PCR menggunakan
pasangan primer spesifik untuk amplifikasi fragmen DNA di antara batas kanan
(RB) dari T-DNA dan ujung 3' dari gen gus.
Ekspresi GUS pada eksplan tersebut ditentukan secara histokimiawi.
Gambar 3. Transformasi gen
Bakteri
Agrobacterium tumefaciens dapat
menginfeksi tanaman secara alami karena memiliki plasmid Ti, suatu vektor
(pembawa DNA) untuk menyisipkan gen asing. Di dalam plasmid Ti terdapat gen
yang menyandikan sifat virulensi untuk menyebabkan penyakit tanaman tertentu.
Gen asing yang ingin dimasukkan ke dalam tanaman dapat disisipkan di dalam
plasmid Ti. Selanjutnya, A. tumefaciens
secara langsung dapat memindahkan gen pada plasmid tersebut ke dalam genom
(DNA) tanaman. Setelah DNA asing menyatu dengan DNA tanaman maka sifat-sifat
yang diinginkan dapat diekspresikan tumbuhan.
Ekspresi Gen
Ekspresi gen adalah terjadinya proses (1) transkripsi DNA (gen)
sehingga menghasilkan hnRNA, (2) RNA Processing sehingga menghasilkan Mrna, (3)
Transfer Mrna dari inti ke sitoplasma, dan (4) Translasi mRNA sehingga
menghasilkan polipeptida. Pada sejumlah gen tertentu, setelah translasi masih
harus melalui proses “Protein Targetting” menuju ke organel, membran atau
bahkan keluar sel.
Gambar 4.
Ekspresi gen
Ekspresi gen biasanya diasosiasikan dengan proses terjadinya
transkripsi yang menghasilkan heteronuclear RNA (hnRNA) atau juga dikenal sebagai
transkrip primer, RNA processing yang menghasilkan mRNA, transfer mRNA
dari nukleoplasma menuju ke sitoplasma, dan translasi mRNA sehingga
menghasilkan polipeptida sesuai dengan runutan DNA pada coding
region mRNA-nya.
Untuk sejumlah polipeptida tertentu, yang gen-nya ada di inti
(bagian dari nuclear genome)
tetapi proteinnya berfungsi dalam organel
(kloroplas atau mitokondria) atau menjadi bagian integral membran sel atau yang
dikeluarkan dari sel ke inter-cellular space,
maka setelah translasi masih harus melalui satu proses lagi yaitu yang disebut
sebagai “protein targetting.”
Gambar 5. Ekspresi gen
Transkripsi adalah proses pertama dalam ekspresi gen.
Inisiasi proses transkripsi dilakukan oleh bagian gen yang dikenal sebagai
promoter. Proses inisiasi transkripsi merupakan proses yang kompleks, yang
melibatkan sejumlah protein dengan fungsi-fungsi tertentu, antara lain: sebagai
faktor transkripsi umum (general
transcription factor) dan RNA polimerase. Produk yang dihasilkan
dari proses transkripsi adalah heteronuclearRNA
(hnRNA) atau juga dikenal sebagai transkrip primer. Transkrip primer umumnya
merupakan produk antara (intermediate products) yang
ada di dalam nukleoplasma dan tidak diakumulasikan di dalam sel tanaman.
Molekul hnRNA (RNA primer) akan mengalami RNA
processing di bagian
5′-non coding region (NCR), bagian ekson dan intron, serta bagian 3′-NCR. Di
bagian 5′-NCR, akan terjadi penambahan gugus 7-metil G-cap (proses capping),
yang fungsinya melindungi ujung 5′ mRNA dari proses degradasi oleh aktivitas
ensim RNase (nuclease). Pada bagian ekson dan intron, akan terjadi proses intro
splicing dan
penggabungan ekson (exon
joining), dan pada bagian 3′ dari RNA akan mengalami proses
pemotongan kelebihan runutan nukleotida (RNA
trimming) dan penambahan ekor poli-(A) atau poly-A
tail. Setelah semua tahapan RNA processing terselesaikan, hasilnya merupakan mature
messenger RNA (mRNA).
Mature mRNA yang dihasilkan selanjutnya akan dikeluarkan
dari nukleus menuju ke sitoplasma. Keluarnya mRNA ke sitoplasma dilakukan
melalui nuclear pore menuju ke sitoplasma untuk sebagian
besar mRNA atau ke endoplasmic reticulum (ER) untuk sebagian mRNA yang lain
(umumnya yang polipeptidanya perlu mengalami modifikasi, misalnya dengan
penambahan gugus senyawa tertentu).
Mature mRNA pada
umumnya ditranslasi di sitoplasma. Bagian 5′-NCR merupakan bagian yang
berinteraksi dengan ribosom untuk proses inisiasi translasi. Dalam proses
inisiasi translasi, satu sub-unit dari ribosom (large sub-unit) akan melakukan scanningdan
mencari codon triplet ATG (start codon). Jika ribosom menemukan codon ATG yang
sesuai, maka sub-unit ribosom yang lain (small
sub-unit) dan t-RNA yang membawa asam amino metionin akan bergabung
dan memulai proses translasi. Satu-per-satu codon triplet pada coding region
dari mRNA akan diterjemahkan menjadi asam amino tertentu sehingga terbentuk
polipeptida lengkap. Ketika ribosom membaca codon triplet UAG, UGA, atau UAA
yang merupakan stop codon, maka
proses translasi akan berhenti (selesai).
Untuk sejumlah polipeptida
tertentu, yang gen-nya ada di inti (bagian dari nuclear
genome) tetapi proteinnya berfungsi dalam organel (kloroplas atau
mitokondria) atau menjadi bagian integral membran sel atau yang dikeluarkan
dari sel ke inter-cellular space,
maka setelah translasi masih harus melalui satu proses lagi yaitu yang disebut
sebagai “protein targetting.”
Melalui protein targetting,
polipeptida akan dikirim ke lokasi yang sesuai menggunakan informasi yang
tersimpan dalam signal peptide atau transit
peptide. ignal peptide atau transit
peptide merupakan
atau berfungsi sebagai alamat kemana polipeptida harus dikirimkan.
Kesimpulan
Dari
uraian diatas dapat ditarik kesimpulan bahwa peranan mikroba dapat menghasilkan
tanaman kakao yang lebih baik, melalui bakteri Agrobacterium tumefaciens yang di transformasi ke dalam sel tanaman
kakao. Pemakaian jaringan embrio zigotik memberikan harapan dalam regenerasi
langsung planlet kakao transgenik.
Daftar
Pustaka
Jawet, dkk. 2001. Mikrobiologi kedokteran.Jakarta:Penerbit
salemba medica.
Muladno, 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor : Penerbit Pustaka Wirausaha
Muda.
Santoso, D., T. Chaidamsari, and A. Budiani. 1997. Perkembangan
awal jaring an beberapa tanaman perkebunan setelah transformasi DNA melalui
Agrobacterium. Prosiding Seminar PBPI : Surabaya
Anggun, 2011. Transformasi Gen Oleh Bakteri Agrobacteri um
tumafaciens. http:// anggunhannes.blogspot.comDi akses
tanggal 30 Oktober 2012
Anonymous, 2011. Tanaman
Tran sgenik. http://pelajaran-jitu.blogspot.com. Di akses
tanggal 30 Oktober 2012.
Anonymous, 2012. Transformasi Gen Pada Tumbuhan Oleh Bakteri
Agrobacterium tumafaciens. http://www. scribd.com. Di akses tanggal 16
Oktober 2012
Tidak ada komentar:
Posting Komentar